Όταν μόλις αποφοιτήσατε και μπήκατε στη δουλειά, βρίσκεστε αντιμέτωποι με ένα σωρό ουσιαστικά που αντιμετωπίζουν ποσοτικά πειράματα PCR σε πραγματικό χρόνο. Είστε μπερδεμένοι σχετικά με το πού να ξεκινήσετε; Τι σημαίνει η καμπύλη ενίσχυσης, η τυπική καμπύλη, το κατώφλι, η τιμή CT, η καμπύλη τήξης και η γραμμή βάσης; Οι φθορίζουσες εικόνες από αυτά τα πειράματα είναι πολύ φωτεινές, αλλά δεν μπορώ να τις αναγνωρίσω. Σήμερα, θα σας οδηγήσουμε να μάθετε αυτές τις γνώσεις και έννοιες σε δύο μέρη: τεχνικούς όρους και συχνές ερωτήσεις.
Μέρος Ι Επαγγελματικοί Όροι
1. Καμπύλη ενίσχυσης
Η καμπύλη ενίσχυσης αναφέρεται στην καμπύλη όπου ο αριθμός κύκλου είναι η τετμημένη και η ένταση φθορισμού σε πραγματικό χρόνο κατά τη διάρκεια της αντίδρασης είναι η τεταγμένη κατά τη διάρκεια της PCR.
2. Βασική γραμμή
Η γραμμή βάσης αναφέρεται σε μικρή αλλαγή στο σήμα φθορισμού κατά τη διάρκεια των πρώτων κύκλων μιας αντίδρασης ενίσχυσης PCR. Το επίπεδο σήματος δείχνει κοντά σε μια ευθεία γραμμή, η οποία είναι η γραμμή βάσης.
3. Ρύθμιση κατωφλίου φθορισμού
Τυπικά, το σήμα φθορισμού των πρώτων 15 κύκλων της αντίδρασης PCR χρησιμοποιείται ως σήμα υποβάθρου φθορισμού και το κατώφλι φθορισμού είναι 10 φορές η τυπική απόκλιση του σήματος φθορισμού κατά τη διάρκεια 3-15 κύκλων της PCR, και το όριο φθορισμού ρυθμίζεται κατά την εκθετική φάση της ενίσχυσης PCR. Τυπικά, κάθε όργανο έχει το όριο φθορισμού του πριν από τη χρήση.
4. Τιμή CT
Η τιμή CT αντιπροσωπεύει τον αριθμό των κύκλων που θα συμβούν για κάθε σωλήνα αντίδρασης PCR όταν το φθορίζον σήμα φτάσει στο καθορισμένο όριο. Από την έρευνα, γνωρίζουμε ότι υπάρχει μια γραμμική σχέση μεταξύ της τιμής CT κάθε προτύπου και του λογάριθμου του αρχικού αριθμού αντιγράφου αυτού του προτύπου. Όσο μεγαλύτερος είναι ο αρχικός αριθμός αντιγράφου, τόσο μικρότερη είναι η τιμή CT και αντίστροφα. Χρησιμοποιώντας πρότυπα με γνωστούς αρχικούς αριθμούς αντιγράφων, μπορεί να γίνει μια καμπύλη βαθμονόμησης όπου η τετμημένη αντιπροσωπεύει τον λογάριθμο του αρχικού αριθμού αντιγράφου, ενώ η τεταγμένη αντιπροσωπεύει την τιμή CT. Επομένως, εφόσον λαμβάνεται η τιμή CT του άγνωστου δείγματος, ο αρχικός αριθμός αντιγράφου του δείγματος μπορεί να υπολογιστεί από την τυπική καμπύλη.
μάθετε περισσότερα
Υπάρχουν διάφοροι δείκτες για να κρίνουμε εάν η καμπύλη ενίσχυσης είναι καλή ή όχι:
Απάντηση: Το σημείο καμπής της καμπύλης είναι προφανές, ειδικά η εκθετική φάση του δείγματος κλάσματος χαμηλής βαρύτητας είναι προφανής, ο συνολικός παραλληλισμός της καμπύλης ενίσχυσης είναι πολύ καλός, η γραμμή βάσης είναι επίπεδη, δεν υπάρχει φαινόμενο ανόδου και η ενίσχυση Η καμπύλη του δείγματος συγκέντρωσης εκθετικής φάσης χαμηλού επιπέδου είναι πολύ καλή. φανερός.
Β: Η κλίση της εκθετικής φάσης της καμπύλης είναι ευθέως ανάλογη με την απόδοση ενίσχυσης, όσο μεγαλύτερη είναι η κλίση, τόσο μεγαλύτερη είναι η απόδοση ενίσχυσης.
Γ: Η τυπική γραμμή βάσης είναι επίπεδη ή ελαφρώς πτωτική, χωρίς εμφανή ανοδική τάση.
Δ: Ο παραλληλισμός των καμπυλών ενίσχυσης για κάθε σωλήνα είναι καλός, υποδεικνύοντας ότι η απόδοση ενίσχυσης κάθε σωλήνα αντίδρασης είναι παρόμοια.
5. Καμπύλη τήξης
Όταν το προϊόν PCR θερμαίνεται, καθώς η θερμοκρασία αυξάνεται, το δίκλωνο προϊόν ενίσχυσης διασπάται σταδιακά, με αποτέλεσμα τη μείωση της έντασης φθορισμού. Όταν επιτευχθεί μια συγκεκριμένη θερμοκρασία, μια μεγάλη ποσότητα προϊόντος διαχωρίζεται, με αποτέλεσμα μια απότομη μείωση του φθορισμού. Η χρήση αυτής της λειτουργίας μαζί με διαφορετικές τιμές TM για διαφορετικά προϊόντα PCR διαφέρει επίσης στη θερμοκρασία στην οποία το σήμα φθορισμού μειώνεται γρήγορα, κάτι που μπορεί να είναι ένας καλός τρόπος για τον προσδιορισμό της ειδικότητας της PCR.
6. Καμπύλη τήξης (με χρήση λογαριθμικής καμπύλης)
Το γράφημα κορυφής σχηματίζεται από τον λογάριθμο της καμπύλης τήξης για να εμφανίζει πιο διαισθητικά την κατάσταση των θραυσμάτων του προϊόντος. Δεδομένου ότι η θερμοκρασία τήξης είναι η τιμή TM ενός θραύσματος DNA, μπορούν να προσδιοριστούν ορισμένες παράμετροι που επηρεάζουν την τιμή TM ενός θραύσματος DNA, όπως το μέγεθος του θραύσματος, η περιεκτικότητα σε GC κ.λπ. Γενικά, σύμφωνα με την αρχή του σχεδιασμού εκκινητών μας, συνήθως λέγεται ότι το μήκος του ενισχυμένου προϊόντος είναι στην περιοχή των 80-300bp και η θερμοκρασία τήξης πρέπει να είναι μεταξύ 80 μοιρών και 90 βαθμών .
Α: Εάν υπάρχει μόνο μία κύρια κορυφή μεταξύ 80 μοιρών και 90 μοιρών, σημαίνει ότι η PCR σε πραγματικό χρόνο είναι τέλεια.
Β: Εάν η κύρια κορυφή εμφανίζεται μεταξύ 80 μοιρών και 90 μοιρών και η κορυφή ακαθαρσίας εμφανίζεται κάτω από 80 μοίρες, λαμβάνεται βασικά υπόψη το εκκινητή-διμερές. Αυτή είναι μια καλή επιλογή για να προσπαθήσετε να λύσετε αυξάνοντας τη θερμοκρασία ανόπτησης.
Γ: Εάν η κύρια κορυφή εμφανίζεται μεταξύ 80 μοιρών και 90 μοιρών και εμφανίζεται μια περιπλανώμενη κορυφή όταν αυξάνεται η θερμοκρασία, λαμβάνεται υπόψη βασικά η μόλυνση του DNA. Και το DNA πρέπει να αφαιρεθεί στα αρχικά στάδια του πειράματος.
7. Τυπική γραμμή καμπύλης
Τα τυπικά πρότυπα αραιώθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις και χρησιμοποιήθηκαν ως εκμαγεία για αντιδράσεις PCR. Η τυπική καμπύλη σχεδιάζεται με τον λογάριθμο του τυπικού αριθμού αντιγράφου ως τετμημένη και τη μετρούμενη τιμή CT ως τεταγμένη. Κατά τον ποσοτικό προσδιορισμό ενός άγνωστου δείγματος, ο αριθμός αντιγράφου του δείγματος μπορεί να ληφθεί από την τυπική καμπύλη με βάση την τιμή CT του άγνωστου δείγματος. Οι τυπικές καμπύλες είναι πολύ σημαντικές για την απόλυτη ποσοτικοποίηση.
το δεύτερο μέρος. κοινό πρόβλημα
Ε1: Ποια είναι η διαφορά μεταξύ RT-PCR, QPCR, PCR πραγματικού χρόνου και RT-PCR πραγματικού χρόνου;
A1: Η RT-PCR είναι PCR αντίστροφης μεταγραφής, η οποία είναι μια ευρέως χρησιμοποιούμενη παραλλαγή της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης. Στην RT-PCR, ο κλώνος RNA μεταγράφεται αντίστροφα σε συμπληρωματικό DNA, το οποίο στη συνέχεια χρησιμοποιείται ως εκμαγείο για PCR για την ενίσχυση του DNA με PCR.
Η PCR σε πραγματικό χρόνο και η QPCR είναι το ίδιο πράγμα, και οι δύο είναι ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο, πράγμα που σημαίνει ότι υπάρχει καταγραφή δεδομένων σε πραγματικό χρόνο σε κάθε κύκλο κατά τη διάρκεια της διαδικασίας PCR. Με αυτόν τον τρόπο, ο αριθμός των προτύπων εκκίνησης μπορεί να αναλυθεί με ακρίβεια.
Αν και τόσο η PCR πραγματικού χρόνου όσο και η PCR αντίστροφης μεταγραφής φαίνεται να συντομεύονται ως RT-PCR, η διεθνής σύμβαση είναι ότι η RT-PCR αναφέρεται συγκεκριμένα στην PCR αντίστροφης μεταγραφής, ενώ η PCR πραγματικού χρόνου συχνά συντομεύεται ως qPCR (Quantitative Real- True Real-True Real PCR ) - time PCR).
Η RT-PCR πραγματικού χρόνου (RT-QPCR) είναι ένας τύπος PCR αντίστροφης μεταγραφής που συνδυάζει φθορίζουσες ποσοτικές τεχνικές: πρώτη αντίστροφη μεταγραφή από RNA για λήψη cDNA (RT), ακολουθούμενη από ποσοτική ανάλυση χρησιμοποιώντας PCR πραγματικού χρόνου (QPCR).
Ε2: Γιατί το μήκος του ενισχυμένου τμήματος προϊόντος της φθορίζουσας ποσοτικής PCR ελέγχεται εντός του εύρους των 80-300bp;
A2: Το μήκος κάθε αλληλουχίας γονιδίου είναι διαφορετικό, μερικά από αυτά είναι αρκετά Kb και εκατοντάδες BP. Ωστόσο, όταν σχεδιάζουμε τον εκκινητή, χρειάζεται μόνο να απαιτήσουμε το μήκος του προϊόντος να είναι 80-300bp και το πολύ μικρό ή πολύ μεγάλο δεν είναι κατάλληλο για ποσοτική ανίχνευση PCR.
Τα θραύσματα του προϊόντος είναι πολύ μικρά για να διακριθούν από τα διμερή εκκινητών. Το μήκος του ασταριού-διμερούς είναι περίπου 30-40bp, όταν είναι μικρότερο από 80 bp, είναι δύσκολο να διακρίνει κανείς εάν πρόκειται για ένα αστάρι-διμερές ή για ένα προϊόν. Εάν το θραύσμα προϊόντος είναι πολύ μακρύ, υπερβαίνει τα 300 bp, θα οδηγήσει εύκολα σε χαμηλή απόδοση ενίσχυσης και η ποσότητα του γονιδίου δεν μπορεί να ανιχνευθεί αποτελεσματικά.
Για παράδειγμα, όταν μετράτε τον αριθμό των ατόμων σε μια τάξη, χρειάζεται μόνο να μετρήσετε πόσα στόματα υπάρχουν. Το ίδιο ισχύει και κατά τον έλεγχο γονιδίων. Χρειάζεται μόνο να ανιχνεύσετε μια συγκεκριμένη αλληλουχία ενός γονιδίου για να αντιπροσωπεύσετε ολόκληρη την αλληλουχία. Είναι εύκολο να κάνεις λάθος αν μετράς στόμα και μύτη, αυτιά και γυαλιά για να μετράς ανθρώπους.
Ε3: Ποιο είναι το βέλτιστο μήκος για το σχέδιο ασταριού;
A3: Γενικά, τα μήκη ασταριού στην περιοχή των 20-24bp είναι καλά. Φυσικά, πρέπει να προσέχουμε την τιμή TM του ασταριού όταν σχεδιάζουμε το αστάρι, γιατί σχετίζεται με τη βέλτιστη θερμοκρασία ανόπτησης. Μετά από πολλά πειράματα, έχει αποδειχθεί ότι οι 60 μοίρες είναι μια καλή τιμή TM. Η χαμηλή θερμοκρασία ανόπτησης μπορεί εύκολα να οδηγήσει σε μη ειδική ενίσχυση, ενώ η υψηλή θερμοκρασία ανόπτησης συνήθως οδηγεί σε χαμηλή απόδοση ενίσχυσης, καθυστερημένη κορυφή της καμπύλης ενίσχυσης και καθυστερημένη τιμή CT.
Ερώτηση 4: Η ποσότητα του δείγματος που συλλέγεται επηρεάζει τα πειραματικά αποτελέσματα;
A4: Όχι. Προφανώς, όσο περισσότερα δείγματα συλλέγονται, τόσο περισσότερο RNA εκχυλίζεται, τόσο περισσότερο cDNA και τόσο περισσότερα θραύσματα στόχου θα υπάρχουν. Για απόλυτη ποσοτικοποίηση, είναι απαραίτητο να υπολογιστεί ο αριθμός αντιγράφων του θραύσματος στόχου και η ποσότητα του δείγματος που συλλέγεται θα επηρεάσει σίγουρα τα πειραματικά αποτελέσματα. Για παράδειγμα, η ανίχνευση του HBV του ιού της ηπατίτιδας C στο αίμα είναι η ανίχνευση της περιεκτικότητας σε HBV σε μια ορισμένη ποσότητα (1 ml) αίματος.
Για τη σχετική ποσοτικοποίηση που χρησιμοποιείται συνήθως στην επιστημονική έρευνα, ο αριθμός των δειγμάτων δεν έχει καμία σχέση με τα πειραματικά αποτελέσματα, επειδή η σχετική ποσοτικοποίηση αναφέρεται στη σύγκριση μεταξύ του γονιδίου στόχου και του γονιδίου αναφοράς. Απλώς, θεωρήστε τα ως θραύσματα ανάντη και κατάντη που υπάρχουν στον ίδιο κλώνο νουκλεϊκού οξέος. Εάν το μέγεθος του δείγματος είναι μεγάλο, τόσο τα γονίδια αναφοράς όσο και τα γονίδια-στόχοι αυξάνονται σε ίσες αναλογίες ταυτόχρονα, κάτι που δεν επηρεάζει τα αποτελέσματα.
Ε5: Η αποτελεσματικότητα της ανάστροφης μεταγραφάσης θα επηρεάσει τα πειραματικά αποτελέσματα;
A5: Το ίδιο με παραπάνω. Σημειώστε ότι θέλουμε υψηλότερη απόδοση RT, αλλά προτιμούμε το ένζυμο RT να είναι σχετικά σταθερό και να έχει ομοιόμορφα αποτελέσματα. Αυτό θα είναι μια δοκιμή των βελτιστοποιημένων δυνατοτήτων των σουιτών αντίστροφης μεταγραφής των μεγάλων εταιρειών.
Ερώτηση 6: Η αποτελεσματικότητα του ενζύμου TAQ επηρεάζει τα πειραματικά αποτελέσματα;
A6: Η αποτελεσματικότητα του ενζύμου TAQ είναι σχετικά μεγάλη. Τυπικά, απαιτούνται ένζυμα taq hot-start και είναι σχετικά αποτελεσματικά. Για εμπορικά κιτ ποσοτικού φθορισμού, κάθε κατασκευαστής θα βελτιστοποιήσει την απόδοση της καλύτερης κατάστασης σύμφωνα με τα δικά του προϊόντα κοντά στο 100 τοις εκατό, εάν η απόδοση είναι πολύ χαμηλή, τα πειραματικά αποτελέσματα δεν μπορούν να ληφθούν. Για τα προϊόντα διαφορετικών εταιρειών, αυτό είναι ένα μέτρο ποιότητας.
Ερώτηση 7: Η ποσότητα της φθορίζουσας βαφής επηρεάζει τα πειραματικά αποτελέσματα;
A7: Ναι, θα γίνει. Εάν το φθόριο είναι πολύ κορεσμένο, μπορεί να προκαλέσει παρεμβολές θορύβου σε ορισμένα όργανα. Εάν το φθόριο δεν είναι κορεσμένο και η τιμή φθορισμού είναι πολύ χαμηλή, θα εισέλθει νωρίς σε μια φάση οροπεδίου και η καμπύλη ενίσχυσης θα είναι επίπεδη. Στο ποσοτικό πείραμα φθορισμού, η τιμή CT φαίνεται κυρίως, επομένως δεν είναι σημαντικό η καμπύλη όψιμης ενίσχυσης να εισέλθει στο στάδιο του οροπεδίου, αλλά η εικόνα δεν είναι αρκετά όμορφη. Εάν έπρεπε να διαλέξετε, ξεκινήστε επιλέγοντας ένα φθοριόχρωμο που είναι ελαφρώς λιγότερο κορεσμένο. Ωστόσο, όταν χρησιμοποιείται το ίδιο προϊόν από την ίδια εταιρεία, η επίδρασή του είναι βασικά αμελητέα.
Ερώτηση 8: Θα επηρεάσει η μετάδοση του σωλήνα PCR τα πειραματικά αποτελέσματα;
Α8: Ναι. Ωστόσο, για την ίδια παρτίδα αναλώσιμων από τον ίδιο κατασκευαστή, αυτό το αποτέλεσμα μπορεί να αγνοηθεί. Αυτή είναι μια καλή επιλογή και είναι καλύτερο να χρησιμοποιήσετε μια 96-πλάκα πηγαδιού με μεμβράνη υψηλής διαπερατότητας για να ελαχιστοποιήσετε την επίδραση της διαπερατότητας του φωτός των αναλώσιμων.
Ε9: Τα σφάλματα κατά τη λειτουργία θα επηρεάσουν τα πειραματικά αποτελέσματα;
A9: Η επίδραση της διαδικασίας λειτουργίας αντανακλάται κυρίως στην ομοιομορφία. Ομοιογένεια σημαίνει ότι όλα τα στοιχεία του συστήματος αναμειγνύονται ομοιόμορφα μεταξύ τους και η φυγοκέντρηση με φλας μπορεί να λύσει αυτό το πρόβλημα. Επιπλέον, για αρχάριους, είναι καλύτερο να ρυθμίσετε το σύστημα PCR ώστε να είναι περισσότερο από 20 ίντσες και ένα σύστημα που είναι πολύ μικρό είναι πιο επιρρεπές σε σφάλματα. Εάν η θερμοκρασία ανόπτησης βελτιστοποιηθεί σωστά, ελαχιστοποιείται η επίδραση της συγκέντρωσης του εκκινητή στην αξονική τομογραφία. Και θα ξέρετε ότι ορισμένα λειτουργικά σφάλματα (όπως η συγκέντρωση ασταριού) μπορούν να αποφευχθούν βελτιστοποιώντας τη θερμοκρασία ανόπτησης.
Συνοψίζω
Τα παραπάνω είναι μερικές ερωτήσεις και ερωτήσεις που αντιμετωπίζουν συχνά οι αρχάριοι κατά τη διάρκεια του πειράματος, ελπίζουμε ότι αυτές οι ερωτήσεις μπορούν να σας βοηθήσουν να λύσετε κάποια σύγχυση. Ο πειραματισμός είναι η διαδικασία δημιουργίας χάους και επίλυσης προβλημάτων, ελπίζουμε ότι θα βγάλετε κάτι από αυτό. Ευχαριστούμε για την ανάγνωση και θα τα πούμε την επόμενη φορά!
