1. Στην πλάκα καλλιέργειας, μουλιάστε τις αντικειμενοφόρες πλάκες που έχουν αναρριχηθεί με PBS τρεις φορές για 3 λεπτά κάθε φορά.
2. Στερεώστε τις αντικειμενοφόρους πλάκες με 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη για 15 λεπτά και μουλιάστε τις αντικειμενοφόρες πλάκες σε PBS για 3 φορές, 3 λεπτά κάθε φορά.
3. Διαπερατήστε με 0,5 τοις εκατό Triton X-100 (παρασκευασμένο σε PBS) για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (για αντιγόνα που εκφράζονται στην κυτταρική μεμβράνη, αυτό το βήμα παραλείπεται).
4. Μπλοκάρισμα ορού: βυθίστε τις αντικειμενοφόρους πλάκες σε PBS για 3 φορές για 3 λεπτά κάθε φορά, στεγνώστε το PBS με απορροφητικό χαρτί, προσθέστε κανονικό ορό κατσίκας (με την προϋπόθεση ότι η δευτερεύουσα πηγή αντισώματος είναι κατσίκα) στις αντικειμενοφόρες πλάκες και κλείστε σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά.
5. Προσθήκη πρωτογενούς αντισώματος: Απορροφήστε το διάλυμα αποκλεισμού με απορροφητικό χαρτί, μην το πλύνετε, προσθέστε επαρκή ποσότητα αραιωμένου πρωτογενούς αντισώματος σε κάθε αντικειμενοφόρο πλάκα και βάλτε το σε υγρό κουτί, επωάστε στους 4 βαθμούς όλη τη νύχτα.
6. Προσθέστε δευτερεύον αντίσωμα φθορισμού: βυθίστε τις αντικειμενοφόρους πλάκες σε PBST για 3 φορές, 3 λεπτά κάθε φορά, απορροφήστε την περίσσεια υγρού στις αντικειμενοφόρους πλάκες με απορροφητικό χαρτί, προσθέστε το αραιωμένο δευτερεύον αντίσωμα φθορισμού στάγδην, επωάστε σε 20-37 βαθμό για 1 ώρα σε ένα υγρό κουτί, μουλιάστε σε φέτα PBST 3 φορές, 3 λεπτά κάθε φορά.
Σημείωση: Από την προσθήκη φθορίζοντος δευτερογενούς αντισώματος, όλα τα επόμενα βήματα θα πρέπει να εκτελούνται σε σκοτεινό μέρος όσο το δυνατόν περισσότερο.
7. Αποκλεισμός ορού: σκουπίστε το υγρό με απορροφητικό χαρτί, ρίξτε κανονικό ορό κατσίκας στη γυάλινη πλάκα (με την προϋπόθεση ότι η δευτερεύουσα πηγή αντισώματος είναι κατσίκα) και κλείστε το σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά.
8. Προσθήκη πρωτογενούς αντισώματος: Απορροφήστε το διάλυμα αποκλεισμού με απορροφητικό χαρτί, μην το πλύνετε, στη συνέχεια προσθέστε το αραιωμένο πρωτεύον αντίσωμα στάγδην και επωάστε όλη τη νύχτα σε ένα υγρό κουτί 4 βαθμών στο σκοτάδι μετά την προσθήκη του πρωτογενούς αντισώματος. (Σημείωση: το είδος του δεύτερου πρωτεύοντος αντισώματος είναι διαφορετικό από το είδος του πρώτου πρωτεύοντος αντισώματος, όπως το ποντίκι και το κουνέλι)
9. Προσθέστε δευτερεύον αντίσωμα φθορισμού: βυθίστε τις αντικειμενοφόρους πλάκες σε PBST για 3 φορές, 3 λεπτά κάθε φορά, απορροφήστε την περίσσεια υγρού στις αντικειμενοφόρους πλάκες με απορροφητικό χαρτί, προσθέστε το αραιωμένο δευτερεύον αντίσωμα φθορισμού στάγδην, επωάστε σε 20-37 βαθμό για 1 ώρα σε ένα υγρό κουτί, μουλιάστε σε φέτα PBST 3 φορές, 3 λεπτά κάθε φορά. (Σημείωση: Εάν έχει επιλεγεί ο κόκκινος φθορισμός για την ανίχνευση του πρώτου αντισώματος, το δεύτερο πρέπει να επιλέξει άλλα χρώματα φθορισμού)
10. Αντιχρωματισμός πυρήνων: DAPI προστέθηκε στάγδην και επωάστηκε στο σκοτάδι για 5 λεπτά, τα δείγματα χρωματίστηκαν και η περίσσεια DAPI εκπλύθηκε με PBST 5 λεπτά × 4 φορές.
11. Στεγνώστε το υγρό στη διαφάνεια με απορροφητικό χαρτί, σφραγίστε τη πλάκα με ένα υγρό στερέωσης που περιέχει σβηστήρα κατά του φθορισμού και παρατηρήστε και συλλέξτε εικόνες κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού.
